EXP - 00132025 / COI-20201092

CARACTERIZACION Y ESTANDARIZACION DE LA DESINFECCION MEDIANTE RADIACION UV-C

30-9-2020

Introducción

A continuación, se describe someramente y de forma sucinta los procesos técnicos realizados hasta la fecha en el trabajo relativo al proyecto. Lógicamente además de estos procesos, los cuales constituyen el objetivo final del proyecto, se han tenido que realizar toda una serie de tareas administrativas y de coordinación que han ocupado hasta la fecha una parte importante del tiempo del equipo de trabajo. Desde Luminalia y el equipo de la UCM esperamos que a partir de ahora el requerimiento administrativo sea inferior y permita acelerar el proceso de obtención de resultados. De forma resumida se puede afirmar que se ha puesto en marcha un sistema de ensayo y caracterización que va a permitir obtener en un muy breve plazo de tiempo (probablemente 2 semanas) resultados tangibles sobre la inactivación del virus covid19 mediante radiación UV-C en entornos reales de aplicación.

 

1.- búsqueda bibliográfica análisis de ensayos previos

                Se ha realizado un estudio exhaustivo de la documentación bibliográfica existente sobre la inactivación de virus y bacterias mediante radiación UV-C.  Se ha hecho especial hincapié sobre aquellos trabajos realizados sobre el virus causante del covid 19. Se han estudiado las principales variables y parámetros físicos que conforman la acción de la radiación sobre medios infectados con el patógeno. Cabe destacar por ejemplo el estudio de Litle (2205) sobre la influencia del ángulo de incidencia sobre el flujo eficiente. Este estudio revela, tal y como se sospechaba por el equipo de trabajo, la necesidad de realizar estudios en los que el ángulo de incidencia sea un parámetro de control. Se han estudiado las curvas de eficiencia espectral en el rango ultravioleta. Se han normalizado los diversos estudios a valores comparables ya que cada uno de ellos expresa las unidades y proceso de forma diferente. De los estudios analizados se ha concluido que es imprescindible el desarrollo exhaustivo y metódico de un procedimiento biológico controlado en sus parámetros físicos ya que como se puede ver en los estudios publicados existe una desviación increíblemente alta. El equipo de trabajo del presente proyecto cree que ello se debe a la falta de control físico de dichos experimentos. Ya de por si el procedimiento de contabilidad biológica, basado en titulaciones y análisis de pruebas que por su propia naturaleza no son del todo homogéneas genera una desviación estándar en los resultados muy elevada, es por ello por lo que es más necesario, si cabe, la medida precisa de las condiciones de los ensayos. Solo por señalar un dato de Kowlaski, el autor con más experiencia en este campo, sobre los trabajos realizados sobre coronavirus de tipo SARS existen desviaciones de más de tres órdenes de magnitud en los resultados.

Fig.1.- Tabla resumen de los datos de la bibliografía.

También a modo de ejemplo señalamos la importancia de lo dicho anteriormente que se puede ver en el que es probablemente el más reciente estudio realizado sobre el covid19 dirigido por Nadia Storm de la universidad de Boston (https://orcid.org/0000-0001-5435-8364 ) en el que se aprecia como la desviación de los datos sobre todo en los crítico niveles bajos de inactivación D90 es elevadísimo.

Fig.2.- Inactivación mediante radiación UVC según N Storm U. Boston.

Se puede apreciar como en las muestras húmedas para 1 sg de radiación, en este caso el tiempo está controlado mediante un shutter por lo que se supone que no viene de ese dato la desviación, si los virus supervivientes rondan el 20% la desviación del resultado es del 10%. Llama, así mismo, la atención que tanto en el caso del medio húmedo como el seco la inactivación en el entorno del segundo es similar siendo en dosis más elevadas cuando aparecen diferencias entre los procedimientos.

Por todo lo visto en este estudio teórico, se impone en el estudio el desarrollo de un procedimiento biológico enormemente cuidado y preciso que permita controlar la desviación de los datos dentro de un orden de magnitud asumible para la aplicación a la que se destina.

 

El Centro de Investigación en Sanidad Animal del Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria, pertenece al Ministerio de Economía y Competitividad. Es un centro de investigación de gran importancia en nuestro país que se crea en 1993 como centro encargado de ampliar e intensificar las actuaciones del Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente, en el ámbito de la Sanidad Animal.

La infraestructura del CISA permite abordar en condiciones de alta Seguridad Biológica las investigaciones necesarias en Sanidad Animal, además de participar de manera muy activa en el desarrollo tecnológico y la cooperación Internacional.

El CISA centra su atención en aquellos aspectos de las enfermedades emergentes, exóticas y de importancia económica que puedan afectar a la ganadería española.

Además, el CISA es uno de los centros de investigación que constituyen la Instalación Científico-Técnica Singular (ICTS) distribuida “Red de Laboratorios de Alta Seguridad Biológica (RLASB).

Al igual que las demás ICTS, la RLASB ofrece un porcentaje significativo de sus servicios esenciales en régimen de ‘Acceso Abierto Competitivo’ para su uso por parte de investigadores del sector público y privado, nacional e internacional, contando con el apoyo del personal técnico y administrativo propio.

 

2.- Desarrollo de protocolo y pruebas de trabajo biológico

Los estudios biológicos se deben llevar a cabo en laboratorios con una clasificación de seguridad de nivel 3 o superior. Este factor restringe enormemente los posibles entornos de trabajo donde llevarlos a cabo. Para ello se ha recurrido al Centro de Investigación en Seguridad Animal dependiente del INIA que se encuentra en la localidad de Valdeolmos.

El centro que se va a encargar de realizar la generación, manipulación, exposición y contabilidad de las poblaciones de virus. Para ello el equipo dirigido por Alejandro Brun ha reservado el uso de una sala de nivel 3 en la que realizar dichos trabajos.

Para el correcto desarrollo de esta tarea que se ha revelado como clave en el éxito del proyecto se han tenido reuniones de trabajo con el personal del CISA. Dado el nivel de protección con el que tienen que trabajar todo el personal implicado en esta tarea resulta primordial la optimización de tiempos, pero sobre todo el control real de los efectos ópticos sobre las muestras.

Fig.3.- Manipulación de los medios infectados en la cabina de seguridad en la sala de nivel 3.

 

Fig.4.- Ejemplo de las muestras tratadas a diferentes niveles de radiación y tiempo

 

Como se puede ver en la figura superior el proceso de radiación produce una inactivación de los virus en función de la fluencia. La contabilidad y evaluación de dicho proceso requiere un complejo sistema ya que es necesario disponer diferentes cargas víricas y realizar las titulaciones de una forma muy cuidadosa. En la figura aparece como las muestras radiadas de la izquierda todavía tienen virus activos y por ello las células que se encuentran a su alrededor han sido contaminadas (zona blanca en la imagen). No obstante, en la figura de la derecha se puede ver como después de un cierto nivel de radiación no se aprecia actividad de propagación de los virus en el cultivo. En la parte solapada se muestra un detalle ampliado de la acción vírica.

 

3.- Diseño y fabricación caja ensayo radiación global

Se ha diseñado y fabricado una caja en la que se puedan exponer las poblaciones de virus a la radiación UV-C de manera controlada y precisa. Dicho diseño ha ido siendo mejorado conforme se han perfeccionado los procedimientos biológicos de trabajo, adaptándose a la operativa e integrando aspectos de trabajo biológico con la precisión óptica necesaria.

4.- Diseño y fabricación caja ensayo radiación angular.

Se ha diseñado y fabricado una caja de ensayo en la que se puede variar de forma controlada la dirección del haz de radiación sobre la superficie de ensayo.

Fig.5.- Detalle del brazo de giro de la luminaria en la caja angular

 

 

 

 

5.- Caracterización de medios biológicos

Se han cultivado células víricas de tipo E6 (ATCC Cat.No. CRL-1586) en un medio de “Eagle “modificado por “Dulbecco” complementado con suero de ternero fetal (FCS) al 5% -10% y L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U / ml) y estreptomicina (100 μg / ml), en atmósfera húmeda de CO2 al 5% a 37 ° C. La semilla de virus utilizada en este estudio fue proporcionada por el Centro Médico Erasmus a través del repositorio EVAg. Brevemente, la cepa SARS-CoV-2 NL / 2020 se propagó una vez en células Vero E6 a una MOI de 0,01. 72 horas después de la infección, se recogieron las células y el sobrenadante se clarificó mediante centrifugación a baja velocidad. Este stock de virus se congeló en alícuotas de 1 ml hasta su uso.

Se ha comprobado tal y como aparece en la figura inferior que las propiedades ópticas del medio influyen enormemente en el resultado del proceso de radiación. Por este motivo se ha diseñado un sistema experimental que permite realizar una estimación de la absortancia en el rango UV-C. Por ejemplo, en una muestra de 3 mm apenas llega radiación a la parte inferior de la misma por lo que si no se tiene en cuenta este hecho los datos de fluencia estarían completamente desviados de la realidad. Por otra parte, este hecho hace imprescindible el desarrollo de un modelo dinámico de evaluación de la que podemos denominar fluencia efectiva en el ensayo. Este modelo es imprescindible ya que posteriormente permitirá la aplicación de este en situaciones reales con una precisión adecuada a la importancia de la función del mismo.

 

 

Fig.6.- Hoja de caracterización Óptica del medio biológico de ensayo

 

 

 

 

 

6.- Caracterización de la emisión espectral de las fuentes de radiación.

La caracterización espectral y no solamente radiométrica de las fuentes de luz, tanto empleadas en los ensayos biológicos como las empleadas en situaciones reales son imprescindibles para el correcto control tanto en el ensayo como en su aplicación en casos reales.

Para ello se han medido las distribuciones espectrales de las lámparas de mercurio a baja presión en función del tiempo de encendido. Se ha podido comprobar que dicha emisión espectral se mantiene estable en los tiempos de trabajo de los ensayos.

Fig.7.- Espectros medidos para la fuente de mercurio a baja presión en diferentes tiempos de estabilización

 

Esta medida ha servido para comprobar como existen unos picos de emisión en el rango UV-B y A que podrían explicar las alteraciones y desajustes de los primeros ensayos realizados debido al procedimiento empleado en los mismos. Dicho procedimiento se cambió, tal y como se explica a continuación, para evitar este efecto.

7.- Caracterización de caja global

Se ha diseñado, fabricado y modificado una caja de radiación global (omnidireccional).

Fig.8.- Planos de fabricación de la caja de inactivación global

La primera caja que se fabricó disponía de un cajón que permitía la extracción de las muestras y evita la radiación al exterior, pero dado que las muestras pasaron de estar en un Petri a en un porta-muestras, para mejorar la fiabilidad del ensayo, y posteriormente se redujo el volumen para uniformizar el proceso de radiación, se optó por hacer un sistema con puerta corredera.

Fig.9.- Proceso de caracterización de la caja de radiación global

Posteriormente se consideró la necesidad de disponer una lámina de obturación que cortasen la radiación en todas las muestras a la vez. Otra modificación del diseño ha consistido en la introducción de una línea de iluminación LED. Se midió la estabilización del sistema LED y el incremento de temperatura.

Fig.10.- Estabilización comparada entre la fuente Hg y la fuente LED (275nm)

Por este motivo se optó por introducir un sistema de disipación pasivo en la zona superior. Como se puede apreciar en la figura superior se ha conseguido una estabilización de flujo muy superior a la inicial del sistema.

Fig.11.- Proceso de medida con la fuente de deuterio y el espectroradiométro

 

 

 

 

 

 

8.- Medida espectral de la emisión UV-C

Se ha medido la distribución de irradiancia punto a punto para poder tener en cuenta esta información en cada una de las muestras de las que se va a controlar su posición y disponer de esta forma de la irradiancia real en cada muestra analizada.

Fig.12.- Distribución de irradiancia en el plano de trabajo de la caja de ensayo

 

9.- Caracterización de caja global en sala de clase III

Los primeros ensayos de prueba denotaron una incongruencia leve pero clara en los datos obtenidos en la sala de nivel III del CISA. Este hecho se podría deber a las condiciones de humedad y temperatura en el interior de dicha sala. Por ese motivo se optó por realizar un proceso de calibración dentro de la sala que permitiera asegurar que las condiciones de trabajo de las lámparas fueran las congruentes en el ensayo y en el modelo.

 

Fig.13.- Proceso de medida in situ de la caja en la sala de nivel III

A pesar de ello una vez realizada la prueba con la calibración in situ, se detectaba una leve desviación de los datos. Esto se podía deber a la inestabilidad en la alimentación eléctrica dado que el centro en esa época tuvo una caída de los sistemas e incluso se tuvieron que reducir el número de salas de trabajo para evitar sobrecargar las zonas de seguridad donde se estaban realizando experimentos, tal y como era el caso en la sala COVID. Para evitar en el futuro cualquier problema con ello se decidió disponer de un sensor que en tiempo real ajustase la calibración del experimento.

 

Fig.14.- Trabajo en la sala de clase III en el CISA.

Fig.15.- Acceso a la sala de nivel III en el CISA

 

 

 

 

 

 

 

 

 

10.- Caracterización de caja angular

Se diseñó y fabricó una caja de radiación que permitiese variar al ángulo de incidencia de la radiación. Para ello se situó la lámpara junto con un diafragma de salida en un brazo orientable de manera que se variase el ángulo de incidencia sobre la muestra vírica.

Fig.16.- Proceso de caracterización óptica de la caja angular

 

Dicho brazo cuenta con una mirilla de apuntamiento y un goniómetro que permite al operario fijar la inclinación de la radiación. La charnela de giro del sistema se dispuso a la altura del plano de medida del radiómetro para evitar, dada la escala del sistema, los fuertes errores que se podrían tener por desalineamiento del detector.

 

Fig.17.- Ajuste del sistema angular al modelo teórico

 

11.- Modelo de radiación en propagación electromagnética

La radiación de rango ultravioleta, y en este caso de tipo C, en torno a los 250 nm, tiene un comportamiento muy distinto de cara a su interacción con los medios materiales muy diferente a la del rango visible. Es necesario, por tanto, desarrollar un modelo de propagación e interacción específicos para esa longitud de onda. Una de las diferencias significativas, y, en este caso, favorables a los sistemas de desinfección, es la escasa penetración en la materia orgánica. Esta diferencia también se aprecia cuando la radiación interacciona con partículas del tamaño de las gotículas, pero sobre todo con partículas del tamaño de los propios virus.

En primer lugar, se ha realizado un cálculo aplicando el modelo de MIE y se ha obtenido la distribución espacial 2D de la luz al interaccionar con una gota de líquido de índice n=1,33 (agua). Se ha realizado un programa de ordenador para traducir dicha distribución a un modelo tridimensional que permita resolver la propagación de un espacio tridimensional. A continuación, se muestra en las figuras el esparcimiento MIE para una longitud de onda de 254 nm y gotas de 1 y 5 micras.

 

Fig.18.- Dispersión de la luz por una gota n=1, de 0,5 mm

 

12.- Modelo fotoquímico de interacción de la radiación

Una de las áreas donde nuestro equipo tiene mayor experiencia es en la modelización de la propagación e interacción de la radiación electromagnética con estructuras de tamaño similar a la longitud de onda de la radiación. El caso que nos ocupa en este proyecto entra en estas escalas y ha de beneficiarse de los resultados obtenidos previamente.

 

Podemos indicar que el virus SARS-Cov2 tiene un tamaño aproximado de unos 200 nm y está formado por diversas estructuras de proteínas, glúcidos, grasas y cadenas de ácidos nucleicos.  Este tamaño es comparable con la longitud de onda en la que se hace este estudio, 254 nm. A su vez, en la mayoría de las circunstancias en las que el virus se convierte en un patógeno contagiable, éste se halla inmerso en un medio acuoso. Por ejemplo, en el interior de gotículas y aerosoles de tamaño micrométrico. 

A su vez, el daño generado por la radiación UV-C afecta a la funcionalidad de las cadenas de ARN que se convierten en inactivas tras haber absorbido fotones UV que han cambiado la morfología natural de esas cadenas. Se trata, por tanto, de un daño fotoquímico causado por la interacción entre fotones UV y el material biológico. Esta interacción inhabilitante se ha de producir en determinadas localizaciones espaciales de la molécula. Por tanto, se trata de un proceso que depende de la probabilidad de que un determinado fotón provoque el daño fotoquímico en un determinado lugar del virus. Así pues, cuanto mayor sea el número de fotones (mayor irradiancia) que ilumina la muestra, y cuanto mayor tiempo pase (mayor fluencia) más probabilidad tendremos de inhabilitar el virus.

Los modelos que pueden describir esta interacción han de tener en cuenta la distribución de campo electromagnético en el interior de esta estructura que, por su forma y su composición, puede ser no uniforme. A partir de esa distribución de campos, nuestro modelo va a evaluar la densidad volumétrica de fotones que existe en el virus y en su entorno. Además, a partir de los resultados obtenidos en la experimentación con muestras biológicas, vamos a ser capaces de conocer los niveles de irradiancia y fluencia capaces de producir un determinado nivel de inactivación.

Nuestro objetivo en este apartado es proporcionar un análisis computacional del daño fotoquímico producido por la radiación UV-C en un modelo de virus. Para ello contamos con la experiencia acumulada en el análisis del comportamiento óptico de pequeñas vesículas en el cristalino humano causantes de las cataratas, y en el análisis de la respuesta espectral del mosaico de detectores retinianos. Todo esto se hizo mediante técnicas de electromagnetismo computacional de gran fiabilidad. La ventaja de estas técnicas es su capacidad de adaptación a diversos tipos de materiales y sistemas. Por ejemplo, resulta sencillo ver las diferencias del comportamiento de la luz cuando existe un metal en contacto con el medio acuoso.

Los resultados de este análisis computacional, junto con otros modelos que funcionan muy bien en tamaños mucho mayores que la longitud de onda, nos deben guiar acerca de las medidas y pruebas que necesitamos hacer en el análisis de la interacción de la luz UV-C y el virus en entornos reales, distintos a los del laboratorio.

En este sentido se está viendo la posible colaboración con el instituto de salud Carlos III y la incorporación de Javier Vargas, profesor de nuestro departamento y experto en esta línea, para la reconstrucción de la estructura tridimensional de los virus una vez han sido radiados.

Si bien este trabajo tiene una complejidad muy elevada, podría aportar información muy relevante al proyecto.

 

Fig.19.- reconstrucción tridimensional de estructuras biológicas nanométricas.

 

13.- Modelo de inactivación en superficies

Con los ensayos previos realizados se ha podido comprobar la enorme importancia de la forma geométrica del medio en el que se encuentra la muestra infectada, así como el soporte que se utiliza para la exposición.

Fig.20.- Disposición de las muestras con virus en los petris de ensayo.

En la figura superior se ve como una vez descartada la inactivación directa en el Petri se optó por disponer las muestras a radiar sobre portamuestras de vidrio, introduciéndose todas ellas a la vez y tapando con la tapa propia de los Petri, la cual se había medido y comprobado que era opaca a la radiación UV-C. Con esta prueba inicial se pudo detectar que la radiación ultravioleta de rango B y A, si bien, mucho menor que la de tipo C, si que podía traspasar las tapas y por tanto alterar los resultados.

Fig.21.- Vista de detalle de las gotas sobre una probeta metálica

 

14.- Incorporación de detector en tiempo real en caja global

Las posibles y descontroladas caídas de tensión en el laboratorio podían producir variaciones de flujo que había que tener en cuenta. Por este motivo se dispuso un detector en tiempo real en el interior de la caja de ensayo. Su lectura a lo largo de la prueba permitiría escalar con precisión la radiación real tenida sobre las muestras en todo momento.

Dado que el sensor iba a estar bajo una radiación altamente energética que podría degradarlo en el tiempo se protegió el cabezal con un filtro que permitió escalar la información en el espectro visible, que tal y como se había comprobado anteriormente era proporcional al emitido en el rango UV-C. Dicho sensor se dispuso fijo en el interior de la caja y se dejó el display de lectura en el exterior.

Fig.22.- Detector de medida en tiempo real

15.- Caracterización radiofotométrica en UVC

De cara a la aplicación real de los sistemas de desinfección es necesario el desarrollo de un sistema de cálculo y control en instalaciones en entorno real.  Dado que las empresas cuentan hoy en día con sistemas desarrollados y estandarizados de fotogoniometría de luminarias se ha realizado un estudio para ver si se podría desarrollar un algoritmo de ajuste que hiciera posible la deducción de la curva radio-goniométrica a partir de medidas realizadas en el rango visible. Como se puede ver en la figura inferior el nivel de desajuste, por otro lado, previsible en este caso, dado que se trata de una luminaria de haz estrecho, la notable diferencia entre ambas hace inviable la transformación directa.

Fig.23.- Curvas radiométricas y fotométricas comparativas de un mismo equipo

Un problema de que deberá estudiarse más adelante es el de la correcta simulación y diseño de instalaciones reales con una traducción de los valores radiométricos a valores de inactivación vírica. A este efecto se está iniciando el desarrollo de una herramienta de cálculo que permita la realización de dicho cálculo real de instalaciones en la que se introduzca, no solamente la radiogoniometría, si no las propiedades de los materiales en dicho rango espectral. Ello va a requerir un adecuado sistema de caracterización 3D de dispositivos y un sistema de caracterización de la reflectancia espectral de los diversos materiales.

En la siguiente figura se muestra el grado de desinfección producido en el plano de trabajo en un local de 20 metros de largo, 20 metros de ancho y cuatro de altura por una luminaria de 36w de mercurio a baja presión durante 8 minutos. Para el cálculo de la inactivación se han utilizado datos publicados por Kowlasky para el COV-SARS-02.

Fig.24.- Planos de inactivación calculados a partir de curvas radiométricas.

El empleo de herramientas como la que se está desarrollando deberá ser una garantía en la aplicación de estos sistemas en espacios reales. Estas herramientas en combinación con detectores de presencia, sistemas de procesado digital de imagen y algoritmos inteligentes permitirán establecer en tiempo real el grado de seguridad de un espacio concreto.

 

16.- Ensayo y modelización del envejecimiento de los materiales

Para este tipo de prueba se ha diseñado una caja específica de ensayo, y se ha mandado fabricar a los talleres de la universidad. La empresa preparará una batería de materiales sobre los que realizar el ensayo para, posteriormente, generar un modelo de envejecimiento. Con dicha información y con la del punto anterior se podrá tomar decisiones sobre los espacios y tiempos a los que se puede someter los diversos espacios.

 

17.- Actividades de difusión.

Se ha realizado una presentación oral en la jornada de CEI Mesa Redonda sobre “Uso de la Tecnología UV-C. Sus riesgos y posibles aplicaciones frente al COVID-19.  17/9/20202” con una participación abierta en la mesa redonda posterior a la misma.

 

 

 

Fig.25.- Portada de la presentación organizada por el Comité Español de Iluminación

 

 

 

 

 

 

En este sentido cabe resaltar que se está preparando la documentación necesaria para proceder a una publicación internacional con alto índice de impacto tan pronto se obtengan los primeros resultados en la fase experimental.

 

 

 

En Oviedo, a 30 de septiembre de 2.020